ՈՒՏԵՔ Չուդինովը, Վ.Ա. Պլատոնով, Ա.Վ. Ալեքսանդրովա, Ս.Ն. Էլանսկի
Վերջերս ցույց է տրվել, որ ascomycete բորբոսը Ilyonectria crassa ի վիճակի է վարակել կարտոֆիլի պալարները: Այս աշխատանքը առաջինն է վերլուծում կարտոֆիլից մեկուսացված I. crassa շտամի կենսաբանական բնութագրերը և դիմադրությունը որոշ ֆունգիցիդների նկատմամբ: «Կարտոֆիլի» շտամի տեսակներին հատուկ տարածաշրջանների հաջորդականությունները համընկնում էին նախորդների հետ, որոնք ձեռք էին բերվել դարֆոդիլի, ջինսենի, կաղամբի և հաճարի, շուշանի լամպերի և կակաչների տերևների արմատներից մեկուսացված: Ըստ ամենայնի, վայրի և պարտեզի շատ բույսեր կարող են I. crassa- ի պաշարներ լինել: Հետազոտված շտամը վարակել է լոլիկի և կարտոֆիլի կտորներով, բայց չի վարակել ամբողջ լոլիկի մրգերն ու անձեռնմխելի կարտոֆիլի պալարը: Սա ցույց է տալիս, որ I. crassa- ն վերքի մակաբույծ է: Ֆլյուդիոքսոնիլին, դիֆենոկոնազոլին և ազօքսիստրոբինին դիմադրողականության գնահատումը սննդարար միջավայրի վրա ցույց է տվել այդ դեղերի բարձր արդյունավետությունը:
EC50 ցուցիչը (ֆունգիցիդի կոնցենտրացիան, որը դանդաղեցնում է գաղութի ճառագայթային աճի տեմպը 2 անգամ ոչ ֆունգիցիդային հսկողության համեմատ) հավասար էր 0.4-ի. Համապատասխանաբար `7.4 և 4 մգ / լ: I. crassa- ի պատճառած հիվանդության զարգացման հնարավորությունը պետք է հաշվի առնել կարտոֆիլի պալարների ֆիտոպաթոլոգիական գնահատման և բույսերի պաշտպանության միջոցառումների մշակման ժամանակ:
Ֆիտոպաթոգեն միկրոօրգանիզմների զարգացումը բերում է մեծ կորուստների կարտոֆիլի աճեցման և պահպանման բոլոր փուլերում: Պաշտպանական միջոցառումներ պլանավորելիս, որպես կանոն, հաշվի են առնվում հայտնի պաթոգեններ, ինչպիսիք են Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora և այլն: Սակայն վերջին տարիներին ավելի ու ավելի շատ տեղեկություններ են հայտնվում կարտոֆիլի վրա նոր ֆիտոպաթոգեն միկրոօրգանիզմների առաջացման մասին: Նրանց կենսաբանությունը թույլ ուսումնասիրված է, անհայտ է կարտոֆիլի վրա օգտագործվող ֆունգիցիդների արդյունավետությունը դրանց նկատմամբ, ախտորոշման մեթոդներ մշակված չեն: Massանգվածային զարգացումով նրանք ունակ են զգալի վնաս հասցնել կարտոֆիլի բերքին: Այս միկրոօրգանիզմներից մեկը ascomycete բորբոս Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous է, որն առաջին անգամ հեղինակները հայտնաբերել են կարտոֆիլի պալարների վրա (Chudinova et al., 2019):
Այս աշխատանքը ներկայացնում է կարտոֆիլի պալարներից մեկուսացված I. crassa շտամի վերլուծության արդյունքները: Ուսումնասիրվել են I. crassa- ի գաղութների և միկելիալ կառուցվածքների մորֆոլոգիան, տեսակների համար հատուկ ԴՆԹ-շրջանների նուկլեոտիդային հաջորդականությունները, կարտոֆիլի և լոլիկի վիրուսայնությունը և որոշ ժողովրդական ֆունգիցիդների նկատմամբ կայունությունը:
նյութեր եւ մեթոդներ
Մենք օգտագործել ենք 18 թ.-ին մեկուսացված I. crassa 2KSuPT2018 շտամը Կոստրոմայի շրջանում աճեցված կարտոֆիլի վարակված պալարից: Պալարի վրա ազդել է չոր հոտի տեսակը ՝ բաց շագանակագույն միկելիումով ծածկված խոռոչով: Օգտագործելով ստերիլ մասնատող ասեղ, սնկային միկելիումը տեղափոխվեց Petri- ի ափսե `ագար միջավայրով (գարեջրի գդալ 10%, ագար 1.5%, պենիցիլին 1000 U / ml): Թիթեղները ինկուբացվում էին մթության մեջ 24 ° C ջերմաստիճանում:
Leica DM2500 լույսի մանրադիտակը ՝ ICC50 HD թվային ֆոտոխցիկով և Leica M80 հեռադիտակի մանրադիտակը ՝ IC80HD թվային ֆոտոխցիկով (Leica Microsystems, Գերմանիա) օգտագործվել են սպորների և սպորային օրգանների չափը և ձևաբանությունը լուսանկարելու, գնահատելու համար:
ԴՆԹ-ն մեկուսացնելու համար սնկային միկելիումը աճեցվեց հեղուկ սիսեռ միջավայրում, այնուհետեւ սառեցվեց հեղուկ ազոտի մեջ, համասեռացվեց, ինկուբացվեց CTAB բուֆերում, մաքրվեց քլորոֆորմով և երկու անգամ լվացվեց 2% ալկոհոլով:
ԴՆԹ արդյունահանման մեթոդը մանրամասն նկարագրված է Կուտուզովայի և այլոց հոդվածում: (2017):
Տեսակները մոլեկուլային մեթոդներով որոշելու և այլ հայտնի I. crassa շտամների հետ համեմատելու համար PCR- ն իրականացվել է նախաներկերով, որոնք թույլ են տվել ուժեղացնել տեսակների համար հատուկ ԴՆԹ-ի շրջանները. ITS1-5,8S-ITS2 (ITS5 / ITS4, սպիտակուցներ և ուրիշներ, 1990) -tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) և թարգմանության երկարացման գործոնը 1α (tef1α) (նախաներկեր EF1-728F / EF1-986R, Carbone and Kohn, 1999): Gelանկալի երկարության ամպլիկոնները արդյունահանվել են գելով `օգտագործելով Evrogen CleanUp հավաքածուն: Ուժեղացված շրջանները հաջորդականացվեցին ՝ օգտագործելով BigDye® Terminator v3.1 ցիկլի հաջորդականության հավաքածուն (Applied Biosystems, CA, ԱՄՆ) Applied Biosystems 3730 xl ավտոմատացված հաջորդականության վրա (Applied Biosystems, CA, ԱՄՆ): Արդյունքում ստացված նուկլեոտիդային հաջորդականություններն օգտագործվել են ԱՄՆ Կենսատեխնոլոգիայի տեղեկատվության ազգային կենտրոնի (NCBI) GenBank տվյալների շտեմարանում համընկնում որոնելու համար: Ֆիլոգենետիկ վերլուծությունը կատարվել է MEGA 6 ծրագրի միջոցով (Tamura et al., 2013):
Վիրուսության որոշումն իրականացվել է խոշոր մրգատու լոլիկի (Դուբրավայի բազմազանություն) և կարտոֆիլի պալարների (գալա սորտ) ամբողջ կանաչ պտուղների վրա: Բացի այդ, վնասված պտուղներին և պալարներին վնաս պատճառելու համար մենք օգտագործեցինք նույն պտուղների և պալարների կտորներ: Պալարների կտորները դրվում էին խոնավ խցիկների մեջ, որոնք Petri- ի ափսեներ էին, ներքևում `թաց ֆիլտրի թուղթ: Թղթի վրա տեղադրվեց սլայդ, որի վրա, իր հերթին, տեղադրվեցին պալարների կամ պտուղների կտորներ: Ամբողջ պալարներն ու պտուղները դրվեցին նաև տարաների մեջ, որոնց ներքևում թաց ֆիլտրային թուղթ էր: Շերտի կենտրոնում (կամ պալարի կամ պտղի անձեռնմխելի մակերեսի վրա) սնկային հարգի վրա 5 օրվա աճելուց հետո տեղադրվել է սնկային հիֆերով ագարի մի կտոր (5 × 5 մմ):
Սնկային շտամների ֆունգիցիդների դիմադրության գնահատումը կատարվել է լաբորատոր պայմաններում `ագարի սննդարար միջավայրի վրա: Մենք ուսումնասիրեցինք ֆունգիցիդային դեղերի նկատմամբ ընկալունակությունը Maxim, KS (ակտիվ բաղադրիչ fludioxonil, 25 գ / լ), Quadris, KS (ազօքսիստրոբին 250 գ / լ), Scor, EC (դիֆենոկոնազոլ 250 գ / լ) (Պետական կատալոգ ..., 2020): Գնահատումն իրականացվել է Petri- ի կերակրատեսակներում `գին-ագար միջավայրի վրա` ուսումնասիրված դեղամիջոցների հավելումով `ակտիվ նյութի 0.1 կոնցենտրացիայով: մեկը; 1 ppm (մգ / լ) (fludioxonil- ի և difenoconazole- ի համար), 10; տասը 1 ppm (azoxystrobin- ի համար) և առանց ֆունգիցիդային միջավայրում (հսկողություն): Ֆունգիցիդն ավելացվեց հալված և սառեցված 10 ° C միջավայրում, որից հետո միջավայրը լցվեց Petri ամանների մեջ: Սնկային միկելիումով ագարի բլոկ տեղադրվեց Petri ուտեստի կենտրոնում և մշակվեց մթության մեջ 100 ° C ջերմաստիճանի պայմաններում: 60 օրվա ընթացքում ինկուբացիայից հետո գաղութների տրամագծերը չափվել են երկու փոխադարձ ուղղահայաց ուղղություններով. յուրաքանչյուր գաղութի չափման արդյունքները միջինացվել են: Փորձերը կատարվել են երեք օրինակով: Վերլուծությունների արդյունքների հիման վրա հաշվարկվել է EC24, որը հավասար է ֆունգիցիդի կոնցենտրացիային, ինչը կրկնակի կրճատեց գաղութի ճառագայթային աճի արագությունը ֆունգիցիդային հսկողության համեմատ:
Արդյունքներ և քննարկում
Սննդի ագարով Petri ուտեստների վրա բորբոսը գաղութներ է կազմել սպիտակ փրփրացող միկելիումով: Միկելիումի տակ գտնվող միջավայրը կարմրաշագանակագույն է դարձել: Երբ միջավայրը չորանում է, փոքր սպորոդոխիայում բորբոսը երկու տեսակի սպորներ է առաջացրել միայնակ և ագրեգացված կոնիդիոֆորների վրա: Մակրոկոնիդիաները երկարաձգված են, գլանաձեւ, մեկից երեք միջնապատերով, միջին երկարությամբ 27.2 մկմ ՝ 23.2-ից 32.2 մկմ արժեքների միջակայքով, լայնությունը ՝ մինչև 4.9 մկմ (նկ. 1): Միկրոկոնիդիայի միջին երկարությունը 14.3 մկմ է ՝ 10.3 – ից 18.1 մկմ արժեքների սահմաններում, լայնությունը ՝ մինչև 4.0 մկմ: Բոլոր մակրո և միկրոմորֆոլոգիական նիշերը տեղավորվում են Ilyonectria crassa տեսակների տատանումների տիրույթում (Cabral et al., 2012):
Տեսակների համար հատուկ ԴՆԹ-ի շրջանների հաջորդականությունները (ITS, b-tubulin, TEF 1α) ամբողջովին համընկնում են I. crassa շտամների հաջորդականությունների հետ, որոնք մենք ավելի վաղ ուսումնասիրել ենք (Chudinova et al., 2019, Աղյուսակ 1): Այլ տարածաշրջաններում I. crassa- ի տարածվածությունն ուսումնասիրելու և ազդակիր մշակույթների սպեկտրը վերլուծելու համար վերլուծվել են GenBank տվյալների բազայի նման ԴՆԹ-ի հաջորդականությունները (աղյուսակ 1): Համընկնումը 86-ից 100% էր: «Կարտոֆիլի» I. crassa շտամի ԴՆԹ-ի բոլոր երեք շրջանների հաջորդականությունները նույնական էին Նիդեռլանդներում շուշանի լամպի և նարգիզի արմատներից մեկուսացված շտամների հաջորդականություններին, Կանադայում ՝ ջինսենի արմատից: Բաց շտեմարաններում մեզ չհաջողվեց գտնել I. crassa- ի այլ շտամներ `երեք վերլուծված նմանատիպ հաջորդականությամբ: Այնուամենայնիվ, նստած ITS և b-tubulin հաջորդականությունների վերլուծությունը ցույց տվեց, որ Մեծ Բրիտանիայում կակաչների տերևների վրա I. crassa- ի առկայությունը: Նմանատիպ իր հաջորդականությամբ սնկերը հայտնաբերվել են Կանադայում կաղամբի արմատների միկոբիոտան, իսկ Իտալիայում ՝ հաճարի արմատները, Սաուդյան Արաբիայում կարտոֆիլի պալարները վերլուծելիս (աղյուսակ 1): Այս ուսումնասիրության արդյունքները ցույց են տալիս, որ I. crassa- ն ունի համաշխարհային բաշխում և ունակ է վարակել տարբեր բուսական տեսակների:
5-րդ օրը լոլիկի և կարտոֆիլի կտորների վրա պաթոգենությունը որոշելու ժամանակ վնասվածքի տրամագիծը հասել է 1.5 սմ-ի: Այնուամենայնիվ, sepals- ը ազդել է լոլիկի վրա: Կարտոֆիլի պալարի կտորի վրա զարգացած միկելիումից աղտոտման հնարավորությունը բացառելու համար սնկային մեկուսացումը մեկուսացվել է մաքուր մշակույթի մեջ: Դա ամբողջովին նույնական էր ծնողական շտամին: Ըստ ամենայնի, I. crassa վերքի մակաբույծ է:
Ֆունգիցիդներով սերմնաբջիջների նախատնկումը բուժումը նվազեցնում է աճող սեզոնի ընթացքում բույսերի վրա հիվանդությունների զարգացումը: Արդյունավետ ֆունգիցիդների ընտրության համար կարևոր է գնահատել, թե դրանցից որն է արդյունավետ I. сrassa- ի դեմ: Աշխատանքն ուսումնասիրել է ֆունգիցիդների լայն տարածում ունեցող ակտիվ նյութերը `ֆլյուդիոքսոնիլ, ազոքիստրոբին, դիֆենոկոնազոլ: Fludioxonil- ը ներառված է մի քանի խառնուրդների մեջ, որոնք օգտագործվում են տնկելուց առաջ սերմերը և սերմնաբջիջները հագցնելու համար: Ֆլյուդիոքսոնիլը (Maxim) օգտագործվում է նաև սերմնաբջիջները բուժելուց առաջ պահեստավորելուց հետո: Difenoconazole- ը և azoxystrobin- ը ներառված են նաև սերմացու նյութի վերամշակման համար օգտագործվող մի շարք պատրաստուկներում, ինչպես նաև բուսական բույսերի վերամշակման համար նախատեսված պատրաստուկներում (Պետական կատալոգ ..., 2020):
I. crassa- ի աճի տեմպը ուսումնասիրվել է ակտիվ նյութերի տարբեր կոնցենտրացիաների մեդիայի վրա (նկ. 2) ՝ ֆլյուդիոքսոնիլ (EC50 = 0.4 ppm), ազօքսիստրոբին (EC50 = 4 ppm) և դիֆենոկոնազոլ (EC50 = 7.4 ppm) (աղյուսակ 2): Այս պատրաստուկները կարելի է համարել խիստ արդյունավետ I. crassa- ի դեմ, քանի որ դրանց EC50- ը զգալիորեն ցածր է, քան պալարների բուժման համար օգտագործվող աշխատանքային հեղուկում պատրաստուկի առաջարկվող կոնցենտրացիան: Ըստ Պետական կատալոգի ... (2020), կարտոֆիլի պալարները բուժելու համար հեղուկի մեջ ֆլդիոոքսոնիլի կոնցենտրացիան 500-ից 1000 ppm է, ազօքսիստրոբինը (փորոտիքի ներքևի մասը մաքրելու հեղուկում) ՝ 3750-9375 ppm, difenoconazole (վեգետատիվ բույսերի բուժման հեղուկում) ՝ 187.5–625 XNUMX ppm
Աղյուսակ 1. Genbank- ի տվյալների բազայում առկա է 18KSuPT2 և Ilyonectria crassa շտամների շտամների տեսակների հատուկ հաջորդականությունների հաջորդականությունը
Լարում | Ընդունող բույս, արտազատման տեղամաս | GenBank- ում ավանդադրված հաջորդականության թվերը, նմանությունների տոկոսը | ՈՒղեցույց | ||
ITS | β-tubulin | TEF 1α | |||
17KSPT1 և 18KSuPT2 | Կարտոֆիլի պալար, Կոստրոմայի մարզ | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, այս աշխատանքը |
CBS 158/31 | Նարգիզի արմատները, Նիդեռլանդներ | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Կաբրալ և այլք, 2012 թ |
CBS 139/30 | Լիլի լամպ, Նիդեռլանդներ | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Ginseng արմատ, Կանադա | AY295311- ը 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Կակաչների տերև, Մեծ Բրիտանիա | KJ475469 100 | KJ513266 100 | Նդ | Դենտոն, Դենտոն, 2014 |
MT294410 | Ասպենի արմատները, Կանադա | MT294410 100 | Նդ | Նդ | Ramsfield et al., 2020 թ |
ER1937 | Բեկ, Իտալիա | KR019363 99.65 | Նդ | Նդ | Tizzani, Haegi, Motta: Ուղղակի ներկայացում |
KAUF19 | Կարտոֆիլի պալար, Սաուդյան Արաբիա | HE649390 98.3 | Նդ | Նդ | Գաշգարի, Գերբաուի, 2013 |
ND = չի ավանդադրվել
Աղյուսակ 2. Ilyonectria crassa- ի դիմադրությունը ֆունգիցիդների նկատմամբ
(ակտիվ նյութ) | EC50, ppm | ||||
3 օր | 5 օր | 7 օր | |||
Վերահսկել | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (դիֆենոկոնազոլ) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
Մեր աշխատանքում, I. crassa շտամները մեկուսացվել են կարտոֆիլի պալարներից Կոստրոմայի և Մոսկվայի (Չուդինովա և այլք., 2019) տարածաշրջաններում: Սաուդյան Արաբիայում կարտոֆիլի պալարների միկոբիոտան վերլուծելիս հայտնաբերվել է I. crassa- ին նույնական ՍԿՏ շտամների սնկային շտամների մեծ համամասնություն (Gashgari and Gherbawy, 2013): Ըստ ամենայնի, I. crassa- ն այնքան հազվադեպ չէ կարտոֆիլի վրա, որքան կարող էր թվալ: Մեր փորձերը ցույց տվեցին, որ բորբոսը կարող է վարակել վնասված լոլիկի պտուղները: Գրականությունից հայտնի է, որ I. crassa- ն ի վիճակի է զարգանալ հողի մեջ սապրոտրոֆիկորեն (Moll et al., 2016), ինչպես նաև ազդել մի շարք բույսերի վրա, նույնիսկ տաքսոնոմիկապես հեռավոր բույսերի վրա, ինչպիսիք են դարբինները, շուշանները, ջինսենը, կաղամբը և հաճարենին (աղյուսակ 1): մեկը) Ըստ ամենայնի, վայրի և պարտեզի շատ բույսեր կարող են I. crassa- ի պաշարներ լինել: Վերոնշյալը ցույց է տալիս, որ պաշտպանական միջոցառումներ մշակելիս անհրաժեշտ է հաշվի առնել այս բորբոսով կարտոֆիլի պալարների վրա ազդելու հնարավորությունը: Fludioxonil, azoxystrobin և difenoconazole պարունակող կարտոֆիլի պալարների բուժման լայնորեն տարածված պատրաստուկները ցույց են տվել I. crassa- ի դեմ ֆունգիցիդային բարձր արդյունավետություն:
Այս աշխատանքին աջակցել է Հիմնարար հետազոտությունների ռուսական հիմնադրամը (դրամաշնորհ թիվ 20-016-00139):
Հոդվածը հրապարակվել է «Բույսերի պաշտպանության տեղեկագիր» ամսագրում, 2020, 103 (3)